Les fluostatines ( BTS métiers de la Chimie )2022. En poursuivant votre navigation sur ce site, vous acceptez l’utilisation de Cookies vous proposant des publicités adaptées à vos centres d’intérêts. . . . . . . .. .. ...... ... Étude structurale.  1. Identifier 5 groupes caractéristiques, présents dans les cycles (1), des membres de la famille des fluostatines. Indiquer le nom de la famille fonctionnelle correspondante. Indiquer également le nom d’une fluostatine contenant le groupe caractéristique concerné. 2. Justifier que la fluostatine K est chirale. Cette molécule possède un atome de carbone asymétrique ( repéré par *). 3. Repérer le(s) centre(s) stéréogène(s) et établir, en justifiant, leur(s) descripteur(s) stéréochimique(s) de la fluostatine ( C).  4. Dénombrer, en justifiant votre réponse, le nombre de stéréoisomères associés à la fluostatine E. Expliquer pourquoi la synthèse doit préférentiellement mener à un stéréoisomère donné. Deux atomes de carbone asymétriques, donc 2 2 = 4 stéréoisomères. L'activité antitumorale dépend de la structure. Extraction d'un milieu de culture.  La fluostatine C a d’abord été obtenue en utilisant la souche de bactéries Streptomyces Acta 1383. Cette bactérie cultivée dans des cuves de fermentations de 20 L fournit des quantités de fluostatines détectables et quantifiables par Chromatographie Liquide à Haute Pression. Le laboratoire de contrôle qualité s’interroge sur la possibilité de mettre au point une méthode spectrophotométrique de dosage par étalonnage permettant de déterminer la quantité de fluostatine C produite par ce procédé. Cette méthode doit pouvoir quantifier une concentration d’au moins 6 10- 6 mol∙L-1 de fluostatine C. Le spectrophotomètre UV-visible utilisé est un spectromètre Cary® 50 UVVis. La cuve spectrophotométrique utilisée, en UV-Silica, laisse passer la lumière dont la longueur d’onde est comprise entre 230 nm et 2500 nm. 5. Déterminer la longueur d’onde de travail la plus adaptée pour détecter la fluostatine C dans les conditions de travail décrites. Pour une meilleure précision, on se place à une longueur d'onde pour laquelle le spectre présente un maximum d'absorption ( par exemple 260 nm ).  On réalise une gamme d’étalonnage de cinq solutions de Fluostatine C de concentrations connues. Leurs absorbances sont mesurées avec trois répétitions de mesure pour chaque solution étalon. Les résultats obtenus sont décrits ci-après : Solution étalon n°1 n°2 n°3 n°4 n°5 Concentration en fluostatine C ( mol / L) 1,00 10-5 3,00 10-5 5,00 10-5 7,00 10-5 9,00 10-5 Absorbance essai 1 0,086 0,259 0,432 0,605 0,778 Absorbance essai 2 0,083 0,251 0,439 0,608 0,783 Absorbance essai 3 0,089 0,263 0,438 0,611 0,781 Une étude est alors menée afin de vérifier la linéarité de la méthode ainsi que ses limites de détection et de quantification. 6. Vérifier la linéarité de la méthode. La courbe est une droite passant par l'origine. fobservé < fcritique.  7. Déterminer les limites de détection et de quantification. Conclure. La limite de détection est la plus petite concentration que l'on peut distinguer du blanc avec un risque de 0,13 %. LD = 3 s(b) / a =3 x4,3 10-3 / (8,698 103)=1,48 10-6 mol / L  La limite de quantification d’une méthode est la concentration minimale qui peut être quantifiée avec un risque à 0,5 °/00. LD = 10 s(b) / a =10 x4,3 10-3 / (8,698 103)=4,94 10-6 mol / L. En sortie des cuves de fermentation, après 162 heures de fermentation, le produit de synthèse est analysé avec le spectrophotomètre UV-visible. L’absorbance mesurée dans les conditions de la méthode décrite précédemment est de 0,387. 8. Déterminer la concentration en fluostatine C en sortie de la cuve de fermentation. C = (A+b) / a =(0,387+1,2 10-3) / (8,698 103) =4,46 10-5 mol / L.  L’analyse par Chromatographie Liquide Haute Pression du filtrat de culture d’une souche de bactérie Streptomyces Acta 1383 après 162 heures de fermentation révèle trois pics attribués à trois fluostatines différentes. Par ailleurs un étalon interne a été ajouté, la caféine, afin de pouvoir quantifier les différentes espèces présentes. Le chromatogramme est représenté ci-dessous et les aires des différents pics sont également fournies. Les aires sous les pics obtenues pour l’échantillon étalon et pour le filtrat sont reportées ci-dessous. Référence Fluostatine C Fluostatine J Fluostatine B Cafeine Concentration ( mg/L) 5 5 5 10 Aire (mAU) 10,8 4,7 9,9 15,9 Filtrat Fluostatine C Fluostatine J Fluostatine B Cafeine Concentration ( mg/L) 10 Aire (mAU) 24,2 1,0 4,6 16,4 9. Déterminer les concentrations en masse des trois espèces de fluostatine C, J et B contenues dans le filtrat. Fluostatine C :   référence : aire pic caféine / aire pic fluostatine C = 15,9 /10,8 =1,47.  filtrat : aire pic caféine / aire pic fluostatine C =16,4 / 24,2 =0,678 ; 1,47 /0,678 x 5 =10,9 mg / L. Autre méthode : KC /ét =CC / Cét xAét / AC =5 / 10 x15,9 / 10,8 =0,736. C'C / C'ét = KC /ét x A'C / A'ét =0,736 x 24,2 / 16,4 =1,086 ; C'C =1,086 x 10 = 10,86 ~10,9 mg / L. Fluostatine J :   référence : aire pic caféine / aire pic fluostatine J = 15,9 /4,7 =3,383.  filtrat : aire pic caféine / aire pic fluostatine J =16,4 / 1,0 =16,4 ; 3,383 /16,4 x 5 =1,03 mg / L. Fluostatine B :    référence : aire pic caféine / aire pic fluostatine B = 15,9 /9,9 =1,606.  filtrat : aire pic caféine / aire pic fluostatine B =16,4 / 4,6 =3,565 ; 1,606 /3,565 x 5 =2,25 mg / L. Synthèse des fluostatines C puis E.  Le travail de l’équipe de Danishefsky a pour objectif la synthèse d’un membre de cette famille qui permettra d’obtenir d’autres fluostatines plus efficaces sur le plan thérapeutique. La fluostatine C est la première espèce chimique de la famille obtenue. La conversion de celle-ci en fluostatine E est alors possible. Le composé de départ de la synthèse de la fluostatine C développée par l’équipe de Danishefsky est le vinylindène (6), obtenu à partir de l’indanone (4). De l’indanone (4) au vinylindène (6) La séquence réactionnelle de cette synthèse est donnée ci-après. On rappelle que le groupement méthoxymétyle MOM- représente le substituant H3C-O-CH2-. 10. Parmi les termes suivants : substitution, addition, élimination, préciser le nom de la réaction à laquelle s’apparente l’étape 2. Addition nucléophile d'un organomagnésien sur le liaison double C=O. Le protocole expérimental de l’étape 2 est donné comme suit. To a stirred and cooled (0 °C) solution of vinylMgBr (1.0 M, 25 mL, 25 mmol) was added dropwise a solution of MOM protected indanone (5) (2.4 g, 12.5 mmol) in THF (10 mL). After stirring at this temperature for 30 min, the reaction was quenched by the addition of aqueous saturated NaHCO3 (30 mL). The mixture was extracted with EtOAc (total of 100 mL). The combined organic extracts were washed with brine (20 mL), dried (Na2SO4) and concentrated. Flash chromatography of the residue over silica gel (2.5 x 16 cm), using 3:1 hexane : EtOAc, gave tertiary alcohol (5’) (2.6 g, 95%) as colorless oil. Analysis of the colorless oil IR spectrum (CH2Cl2, cast) : 3567, 2955, 1591, 1475, 1153, 1039 cm-1 .  11. Nommer la technique utilisant l’acétate d’éthyle pur (EtOAc) dans ce protocole (indiquée en gras). Rédiger, en quelques lignes, le protocole permettant sa mise en œuvre. Extraction par solvant. Cette technique repose sur la solubilité de l'espèce à extraire dans un solvant donné. Ce dernier ne doit pas être miscible avec l'eau ; il doit dissoudre facilement l'espèce à extraire et être liquide à la température de l'extraction. Placer la mixture dans une ampoule à décanter et ajouter le solvant d'extraction ; boucher et agiter ; dégazer ; placer un becher sous l'ampoule, laisser couler le liquide le plus dense. Les spectres RMN 13C, découplés du proton, du substrat et du produit d’intérêt obtenu lors de l’étape 2, en solution dans CDCl3, sont donnés ci-après. 12. Justifier que ces spectres permettent d’affirmer que le produit d’intérêt obtenu dans le protocole de l’étape 2 est celui attendu et que la chromatographie flash a permis de le purifier. Disparition du pic à 203 ppm ( carbonyle de la cétone). Apparition des pics relatifs à la liaison double C=C vers 150 ppm. Apparition du pic relatif à la liaison C-OH alcool vers 84 ppm. 13. Expliquer pourquoi l’étape 3 est cataloguée comme une élimination. Elimination de H2O : le groupe OH de l'alcol tertiaire disparaît au profit d'une liaison double C=C.  Le protocole de l’étape 3 est décrit comme suit. A solution of tertiary alcohol (5’) (2 g, 9 mmol) in benzene (55 mL) containing I2 (50 mg) and quinoline (0.3 mL) was heated to reflux for 2 h. After cooled to room temperature, the above solution was concentrated to 1/3 volume, which was purified by flash chromatography over silica gel (2.5 x 18 cm), using 4:1 hexane:ether, gave diene (6) (ca. 1.25 g, 68 %) as slightly yellowish oil, which was used immediately in the next step. Analysis of the yellowish oil IR spectrum (neat) 3095, 2954, 2895, 1583, 1471, 1248, 1151 cm-1 .  14. Justifier la nécessité de remplacer le benzène par un autre solvant. Proposer un solvant de substitution, en justifiant le choix effectué. Benzène : toxique, cancérogène, neurotoxique central. Le benzène sera remplacé par le cyclohexane.  15. Représenter et légender un schéma du montage utilisé pour réaliser la synthèse du diène (6). 16. Montrer que l’analyse par spectroscopie infrarouge confirme que la transformation souhaitée a effectivement eu lieu. Disparition de la bande relative à O-H libre vers 3600 cm-1. Apparition d'une bande vers 1583 cm-1, double liaison C=C conjuguée. Chromatographie flash. L’équipe a choisi, dans cette synthèse totale et pour chaque étape, une technique de purification appelée chromatographie flash, applicable aussi bien aux solides qu’aux liquides. 17. Citer les deux techniques courantes de purification utilisées au laboratoire, remplacées ici par la chromatographie flash. Filtration, centrifugation, évaporation, extraction. 18. Proposer une technique d’analyse courante, au laboratoire, se rapprochant de la chromatographie flash. Chromatographie sur colonne. ... .... Du vinylindène (6) à la fluostatine C.  La séquence réactionnelle de la synthèse de la fluostatine C et les conditions opératoires sont présentés ci-après. 19. Déterminer le nombre d’étapes conduisant à la fluostatine C. 12 étapes.  20. Déterminer le rendement de la synthèse. Commenter la valeur obtenue. étape a b c d e f g h i j k l rendement 0,93 0,92 0,92 0,93 0,88 0,72 0,69 0,61 0,99 0,90 0,47 0,85 0,93 x0,92 x0,92 x0,93 x0,88 x0,72 x0,69 x0,61 x0,99x0,90 x0,47 x0,85 ~0,07 (7 %), valeur très faible. 21. Donner, en justifiant la réponse, le lien stéréochimique entre les composés (22a) et (22b). Un seul atome de carbone asymétrique ( n° 3) change de configuration, donc diastéréoisomères. 22. Justifier que l’obtention de la fluostatine C ne nécessite pas la séparation des différents couples d’intermédiaires a et b présents dans la séquence réactionnelle. Les atomes de carbone asymétriques 1 et 2 ont la même configuration. Les atomes de carbone asymétriques 3 et 4 disparaissent au profit d'une liaison double C=C.  Donner le rôle du groupement méthoxyméthyle MOM- dans la séquence réactionnelle, permettant d’obtenir la fluostatine C. Identifier et nommer les deux étapes clés qui lui sont associées dans les séquences réactionnelles de l’indanone (4) au vinylindène (6) et de la synthèse de la fluostatine C. Protection de la fonction phénol  (étape 1). Déprotection de cette fonction ( étape i). De la fluostatine C à la fluostatine E.  La fluostatine C présente une activité modérée. Il est possible de la transformer en fluostatine E dont les propriétés thérapeutiques sont plus puissantes ; l’étape réactionnelle, résumant la transformation chimique et présentant les conditions opératoires, est donnée ci-après. L’étude du mécanisme réactionnel de cette transformation chimique permet d’en comprendre la régiosélectivité. Les deux actes élémentaires sont les suivants.  24. Identifier l’intermédiaire réactionnel de la transformation chimique de la fluostatine C en fluostatine E. Compléter le mécanisme de la réaction à l’aide du formalisme des flèches courbes dans le cas des deux attaques nucléophiles possibles. 25. À l’aide du mécanisme et des profils réactionnels expliquer la régiosélectivité de cette addition. L'atome de  carbone en alpha du carbonyle porte une charge partielle positive. La formation de E est favorisée. Le protocole expérimental mis en œuvre pour transformer la fluostatine C en fluostatine E est le suivant.  To a stirred solution of fluostatin C (12 mg, 3,7 × 10-2 mmol, orange powder) in acetone (0.5 mL) was added an aqueous 1 mol·L-1 HCl (0.05 mL). Stirring was continued for 10 min. Solvent was evaporated. Flash chromatography of the residue over silica gel (2 x 18 cm), using 9:1 CH2Cl2 : MeOH, gave fluostatin C (7.0 mg) and fluostatin E (5.3 mg,) as orange powder. A une solution agitée de fluostatine C ((12 mg, 3,7 × 10-2 mmol, poudre orange) dans de l'acétone ( 0,5 mL) a été ajouté à une solution aqueuse de HCl 1 mol / L ( 0,05 mL). L'agitation a été poursuivie pendant 10 min. Le solvant a été évaporé. On obtient  de la fluostatine C ( 7,0 mg) et de la fluostatine E (5,3 mg) sous forme de poudre orange. 26. Déterminer la valeur du taux de conversion de la fuostatine C au cours de cette étape. Proposer une démarche expérimentale permettant de l’augmenter. 12-7,0 = 5,0 mg de fluostatine E a été convertie  soit 5,0 /12 ~0,42  ( 42 %).  27. Déterminer la valeur du rendement en fluostatine E.  La mise en œuvre au laboratoire ne permet pas d’obtenir la masse attendue de fluostatine E. Afin de trouver une explication à cette différence obtenue, l’équipe de synthèse du laboratoire souhaite vérifier, par un titrage, la concentration de l’acide chlorhydrique, solution notée S, utilisé pour cette synthèse. 28. Choisir un étalon adapté au titrage de l’acide chlorhydrique S parmi les propositions pKs(AgCl)= 9.75 ; pKs(AgBr)= 12.30 ; pKs(agI)= 16.08 ; pKs(AgOH)= 7.7 ; pKs(Ag2CrO4)= 12. Le choix de l’équipe du laboratoire se porte finalement sur l’utilisation du nitrate d’argent comme étalon qui servira à titrer l’acide chlorhydrique. La solution S est tout d’abord diluée au centième, puis on prélève 50 mL de cette solution diluée que l’on introduit dans un bécher avec 250 mL d’eau distillée.  29. Rédiger un protocole pour diluer au centième l’acide chlorhydrique S avec la précision adaptée. Fateur de dilution : 100. Fiole jaugée de 100,0 mL contenant 1 /3 d'eau distillée ; y ajouter 1,0 mL d'acide chlorhydrique prélévé à l'aide d'une pipette jaugée de 1,0 mL. Compléter à l'aide d'eau distillée jusqu'au trait de jauge. Boucher et agiter pour rendre homogène. La solution de nitrate d’argent préparée à une concentration de 0,050016 ± 0,000002 mol·L-1 .  30. Déterminer la masse de nitrate d’argent commercial disponible à peser pour préparer 1 L de la solution de nitrate d’argent à 0,050016 mol·L-1. M(AgCl) =143,32 g / mol. 143,32 x 0,050016 =7,1683 g. Le titrage est suivi par conductimétrie. La courbe de titrage est fournie ci-dessous : 31. Justifier l’allure de la courbe de titrage obtenue. Avant l'équivalence l'ion Ag+ est en défaut. Du point de vue de la conductimétrie, tout se passe comme si on remplaçait l'ion  chlorure par l'ion nitrate, de conductivité molaire ionique moindre : la conductivité diminue lentement. Après l'équivalence, l'ion argent  est en excès: on ajoute des ions argent  et des ions nitrate, la conductivité croït rapidement. 32. Exploiter les données du titrage pour déterminer la concentration de l’acide chlorhydrique S utilisée. Écrire ce résultat en tenant compte d’une incertitude-type associée à la concentration de la solution S de valeur 4,7 x10-3 mol.L-1. Conclure. A l'équivalence : n(Ag+) = 8,56 x0,050016 =0,428 mmol. n(HCl) = 0,428 mol dans 50,0 mL. 0,428 / 0,0500 =8,56 mmol / L Tenir compte de la dilution : 8,56 10-3 x100 =0,856 ±4,7 10-3 mol / L.

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