HPLC.
Concours assistant d'ingénieur Maine 2015.
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1. Quels sont les trois principaux types de chromatographie ?
D'après
la nature de la phase mobile : chromatographie sur couche mince ;
chromatographie en phase gazeuse ; chromatographie en phase liquide.
D'après le type d'interaction : chromatographie d'adsorption ; chromatographie de partage ; chromatographie à échange d'ions.
2. Définir le principe de la chromatographie liquide haute performance.
L'échantillon
à analyser est entraîné par la phase liquide mobile dans une
colonne remplie d'une phase stationnaire constituée de grains de petite
taille. Un débit élevé de la phase mobile et cette fine granulométrie
permet une bonne séparation des composants.
3. Faire
un schéma de principe du fonctionnement d'un système de chromatographie
liquide haute performance en indiquant les principaux composants.
La colonne ( tube construit avec un matériau
inerte aux produits chimiques) contient la phase
stationnaire :
- phase normale : gel de silice polaire ; on
utilise un éluant apolaire ; les produits polaires
sont retenus dans la colonne, les produits apolaires
sortent en premiers.
- phase inverse : phase fixe apolaire ;
éluant polaire ; les molécules polaires
sortent en premier.
Détecteur UV-visible ; réfractomètre
( mesure de l'indice de réfraction du liquide
à la sortie).
4. Classer les solvants suivants du moins polaire au plus polaire.
Cyclohexane ; chloroforme ; acétone ; DMSO ; acétonitrile ; éthanol ; méthanol ; eau.
6- 7. Qu'est ce qu'une colonne en phase inverse. Citer deux types de greffage de colonne en phase inverse.
phase normale :
gel de silice polaire ; on utilise un éluant apolaire ; les produits
polaires sont retenus dans la colonne, les produits apolaires sortent
en premiers.
- phase inverse : phase fixe apolaire ( colonne garnie de silice greffée C18 , phényl, CN) ; éluant polaire ; les molécules polaires sortent en premier.
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8.
Le dosage du chloramphénicol (CAP) est effectué en chromatographie
liquide avec détecteur UV à 270 nm. La méthode de l'étalon interne est
utilisée. Cet étalon est la caféine. Le solvant de dilution est le
méthanol. Quatre points d'étalonnage sont réalisés :
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Volume total = 1 mL
Concentration de CAP µg /mL
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Concentration caféine en µg/mL
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étalon point 1
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10
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10 |
étalon point 2
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20
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étalon point 3
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30
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étalon point 4
|
40
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Chaque solution étalon est préparée comme suit :
A. Pesée de l'étalon interne.
Volume total final de la solution : 1 mL.
Concentration finale en caféine : 10 µg /mL, volume à ajouter : 20µL.
Calculer la concentration de la solution mère de caféine à préparer.
Facteur de dilution : 1 mL = 1000 µL ; 1000 / 20 = 50.
La solution mère est 50 fois plus concentrée soit 50*10 = 500 µg / mL
ou 0,5 mg de caféine par mL de solution ( 0,5 g / L).
Il faut peser 0,5 g de caféine et dissoudre le solide dans 1 L d'eau
distillée à température modérée ( 40 - 50 °C). La solubilité de la
caféine étant faible ( 2,2 g/L à 20°C) est plus importante à chaud (
180 g/L à 80°C).
B. Ajout du chloramphénycol ( CAP).
A partir de la solution mère de CAP à 1 mg /mL ( 1000 µg / mL),
calculer les volumes nécessaires à ajouter pour préparer 1 mL de chaque
point de la gamme étalon.
Etalon 1 : facteur de dilution F = 1000 / 10 = 100. Prélever 10 µL de solution mère de CAP.
Etalon 2 : prélever 20 µL de solution mère de CAP.
Etalon 3 : prélever 30 µL de solution mère de CAP.
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Volume caféine
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Volume CAP
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Volume MeOH
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Total
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étalon point 1
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20 µL
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10 µL
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970 µL
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1000 µL
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étalon point 2
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20 µL
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960 µL
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étalon point 3
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30 µL
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950 µL
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étalon point 4
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40 µL
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940 µL
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Les résultats d'analyse sont les suivants :
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Volume
injecté µL
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CAP
µg/mL
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CAP µg
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Aire du
pic CAP
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caféine
µg/mL
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caféine µg
|
Aire du
pic caféine
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étalon point 1
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1
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10
|
0,01
|
640
|
10
|
0,01
|
1147
|
étalon point 2
|
20
|
0,02
|
1268
|
1113
|
étalon point 3
|
30
|
0,03
|
1842
|
1100
|
étalon point 4
|
40
|
0,04
|
2400
|
1128
|
Echantillon inconnu
|
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1375
|
1108
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Calculer la quantité de CAP dans l'échantillon à doser.
L'aire
sous le pic est en général proportionnelle à la quantité de matière
injectée. Or le volume injecté est très faible et sa reproductibilité
est insuffisante pour obtenir des résultats précis.
La méthode de l'étalon interne rend les résultats indépendants du
volume injecté tant que l'on reste dans le domaine linéaire de réponse
du détecteur.
| étalon point 1 | étalon point 2 | étalon point 3 | étalon point 4 | échantillon inconnu | Aire du pic CAP
par rapport à l'aire del'échantillon | 0,558 | 1,14 | 1,40 | 2,13 | 1,24 | | CAP µg | 0,01 | 0,02 | 0,03 | 0,04 |
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On trace la courbe aire du pic CAP/ aire pic échantillon en fonction de CAP µg.
 y = 49,76 x +0,06 ;
x = (1,24-0,06) / 49,76 = 0,0237 µg.
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