Electrophorèse, électrofocalisation. Agrégation 2015

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Electrophorèse.
Cette technique consiste à séparer des espèces chimiques chargées au moyen d'un champ électrique. Le mélange à analyser est déposé au centre d'une bande de papier imbibé d'une solution tampon. Un champ électrique est appliqué aux extrémités du papier pendant une durée variable selon les espèces à séparer. Les composés séparés seront ensuite détectés.
On étudie la séparation de l'acide aspartique et d'argiline selon cette technique dans un tampon de pH=6. Au moment du dépôt, le profil de concentration le long de la bande de papier en fonction de la distance x au pôle négatif àl'allure suivante,l'origine du repère étant l'extrémité de la bande de papier reliée au pôle négatif du générateur.

Après application du champ électrique pendant une durée t, on obtient le profil final de concentration suivant :

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26 Comment fabriquer une solution tampon de pH=6 à partir d'hydrogénophtalate de potassium et d'hydroxyde de sodium en solution ( les deux solutions ayant une concentration de 0,1 mol/L). A quelle condition cette solution imposera t-elle son pH sur la totalité du dispositif ?
pKa( acide phtalique / hydrogénophtalate) =2,89.
 pKa( hydrogénophtalate/phtalate) =5,51.
Ajouter V mL de soude à V' mL de la solution d'hydrogénophtalate de potassium.
hydrogénophtalate + HO- --> phtalate + H2O.
pH = pKa + log ([phtalate] /[hydrogénophtalate ].
[phtalate] = 0,1 V /(V+V') ; [hydrogénophtalate ] = (0,1 V'-0,1V)/(V+V').
pH-pKa = log(V /( V'-V)) ; 6-5,51 = 0,49.
V /( V'-V) =3,,09 ; V'/V-1 = 0,324 ; V' / V = 1,324.
Le pH d'une solution tampon varie peu par ajout modéré de base, d'acide ou par dilution. Les espèces chimiques déposées sur le papier doivent avoir une concentration très inférieure à celle du tampon.
27. Attriibuer les valeurs de pKa (2,2 ; 9 et 12,5) aux groupes correspondants dans le cas de l'argiline.
Pourquoi la valeur de pKa(3) est-elle si différente de celle de pKa(2) ?
2,2  correspond à -CO2H /-CO2-.
9 correspond à -NH3+/-NH2.
12,5 correspond au couple acide/base de la chaîne latérale. Cette valeur élevée  est due  à la forme acide stabilisée par résonance.
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28. Sous quelle forme se trouve les deux acides aminés sur la bande de papier ?
A pH=6, l'argiline est sous sa forme acide, donc chargée positivement.
PKa de l'acide aspartique ( 2,2 ; 3,9 et 9,8).
A pH=6, l'acide aspartique est chargé négativement.
29. Identifier chacun des deux acides aminés sur la bande de papier.
L'argiline chargée positivement migre vers l'électrode négative, vers la gauche.
L'acide aspartique chargé négativement migre vers l'électrode positive ( vers la droite).
30. Indiquer de manière qualitative l'évolution au cours du temps du profil de concentration du mélange en absence de champ électrique. Quel serait l'aspect du profil de concentration au bout d'un temps infini ?
La diffusion diminue la hauteur du pic et provoque son élargissement.
Au bout d'un temps infini, la concentration est uniforme sur toute la bande de papier.
31. Donner l'aspect du profil de concentration pour le mélange d'acides aminés à séparer après une durée de migration 2t.
La vitesse de migration ne changeant pas,les espèces continuent à migrer vers les pôles ; les pics s'élargissent du fait de la diffusion.









Electrofocalisation.
Pour la plupart des protéines, il existe un pH isoélectrique, pour lequel la charge globale de la protéine est nulle.
Appliquée aux protéines, la technique de l'électrophorèse est modifiée en imposant un gradient de pH parallèle au champ électrique.
Par rapport à l'électrophorèse, on observe :
- que la migration des espèces cesse au bout d'un certain temps d'application du champ électrique ;
- quà la fin de la migration, la suppression du champ électrique provoque un élargissement des bandes ;
- que le rétablissement du champ électrique( après sa suppression et l'élargissement des bandes ) permet de retrouver des bandes fines :
 - que les bandes obtenues par cette technique sont plus fines qu'en électrophorèse simple.
32. Indiquer, en le justifiant, quel doit être le sens de gradient de pH par  rapport au sens du champ électrique pour obtenir une séparation des espèces chargées.
Diagramme de prédominance des espèces chargées autour du pHi :

Tant que le pH du papier est inférieur à pHi, la protéine chargée positivement migre dans le sens du champ, vers la droite.
Si le pH est supérieur à pHi, la protéine chargée négativement migre en sens contraire du champ, vers la gauche.
 33. Interpréter les quatre observations décrites ci-dessus.
1. Lorsque les espèces atteignent la zone où pH=pHi, leur charge globale est nulle : la migration cesse.
2. En absence de champ, la diffusion élargit les bandes.
3. Lors du rétablissement du champ, la migration des espèces reprend, on retrouve des bandes fines.
4. La diffusion est compensée par l'effet du champ électrique : les bandes sont très fines.
34. Justifier le terme électrofocalisation.
"électro" fait allusion au champ électrique.
"focalisation" fait allusion  à l'optique : chaque espèce est concentrée sur une distance très faible.



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