Ibuprofène, techniques chromatographiques
Concours externe technicien police technique et scientifique 2016.




Exercice 1. pH
La molécule  d'ibuprofène a pour formule :

C'est un acide faible noté RCOOH, de pKa  = 4,5.
1.
Combien de carbone asymétrique possède-t-elle ? Identifier les ? Conclure.
La molécule compte un atome de  carbone asymétrique repéré par *. Il existe donc deux énantiomères.
2. Le pH du sang est d'environ 7. Quel est le rapport entre la concentration de la base RCOO- et celle de l'acide conjugué dans le sang ?
pH = pKa + log ([RCOO-] / [RCOOH]) ;
log ([RCOO--] / [RCOOH])= pH - pKa =7-4,5 = 2,5.
([RCOO--] / [RCOOH] = 102,5 ~316.
3. pH d'une ssolution d'ibuprofène à 0,1 M.
a. Ecrire les différents équilibres chimiques qui s'établissent dans cette solution aqueuse.
RCOOH + H2O = RCOO- + H3O+.
2H2O = H3O+ +HO-.
b. Calculer le pH de cette solution.

Avancement volumique
RCOOH
+ H2O = RCOO- + H3O+
Initial
0
0,1
Solvant
0
0
à l'équilibre
x
0,1-x
x
x
Ka = 10-4,5 = 3,16 10-5 = x2 /(0,1-x).
x2 + 3,16 10-5 x - 3,16 10-6 =0.
D =(
3,16 10-5 )2 +4*3,16 10-6 =1,264 10-5 ; D½ =3,555 10-3.
x =(
3,16 10-5 +3,555 10-3 )/2=1,79 10-3.
pH = - log (
1,79 10-3) = 2,75.
4. On dose la solution d'ibuprofène par la soude..
a. Ecrire l'équation  de la réaction qui se produit entre la soude  et l'ibuprofène.
RCOOH aq + HO- aq ---> RCOO-aq +H2O(l).
b. Calculer la valeur de la constante d'équilibre de cette réaction et vérifier que cette réaction peut être considérée comme totale.
K = [
RCOO-aq] / ([RCOOH aq] [HO- aq] =Ka / Ke = 10-4,5 / 10-14 =109,5 ~ 3,16 109.
K est très grand, la réaction est totale.
c. On souhaite suivre le dosage par pHmétrie, d'un point de vue pratique, quel type délectrodes utiliseriez-vous pour mesurer le pH de la solution ?
Electrode combinée ( électrode de verre ( pour la mesure du pH) et une électrode au calomel saturée ( référence)).
d. Une solution contient un mélange d'ibuprofène et de kétoprofène  ( pKa = 4,6 à 298 K). On dose ce mélange par une solution de soude. Les deux composés seront-ils dosés séparément par la soude ?
Non, les pKa des deux couples acide / base  sont trop proches l'un de l'autre.

Exercice 2, analyses chromatographiques.
Partie 1 : chromatographie en phase gazeuse.
L'ibuprofène peut être détecté par chromatographie en phase gazeuse muni d'un  détecteur à ionisation de flamme ( CG/FID).
1. Rappeler brièvement le principe de la chromatographie gazeuse.
Un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire. 
A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne. Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne.
 
De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés.
Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic.

2.a. Quelles sont les caractéristiques de ces gaz pour ne pas endommager la colonne ?
Le gaz vecteur doit être pur, inerte (il ne doit pas réagir avec les constituants de l'échantillon à séparer) et non miscible avec la phase stationnaire.
2.b. Dans la théorie des plateaux, que représente H ( appelé aussi HEPT). Comment évolue l'efficacité d'une colonne en fonction de H ?
Une colonne à N plateaux théoriques est une colonne divisée en N petits disques successifs ; elle se comporte comme une colonne à distiller de N plateaux.  La phase mobile progresse par sauts successifs d'un plateau à un autre. Dans chaque plateau on observe une rétention du soluté.
La hauteur équivalente  à un plateau théorique estégale à  H = L / N, indépendant de la longueur de la colonne.
Une bonne colonne à chromatographie donne des pics fins pour des temps de rétention élevés. Le nombre de plateaux théoriques est grand. Plus H est petit, plus la colonne  est efficace.
2.c. Justifier le choix de l'hydrogène comme gaz vecteur.
Allure des courbes de Van Deemter :
Le minimum  des courbes pour He et H2 sont larges et se produisent pour des débits plus élevés, ce qui signifie une analyse plus rapide. He, non inflammable est souvant préféré à H2.
3. Définir le temps mort. Calculer le temps mort puis estimer le temps de rétention réduit de l'ibuprofène. Colonne Rtx-5 ( 30 m x 0,25 mm x 0,5 µm ). Injecteur de type split. Ratio de split 1 : 10. Volume injecté :  2 µL. Gaz vecteur : hydrogène 0,6 mL / min.


Le temps mort, noté tM ou t0 est le temps que met un soluté non retenu ( l'air dans le  cas de la CPG ) à sortir de la colonne. En HPLC, c'est le temps mis par la phase mobile pour traverser la colonne.
Temps de tétention réduit : l'origine est le pic du temps mort et non pas le moment de l'injection.
On note u la vitesse linéaire ( m / s) de la phase mobile dans la colonne , D le débit , L la longueur de la colonne et r son rayon.
D =pr2L / t et u = L / t  ; u =D / (
pr2).
D = 0,6 10-6 / 60 = 1,0 10-8 m3 s-1 ; r = 0,125 mm = 1,25 10-4 m.
u =
1,0 10-8 / (3,14 *(1,25 10-4)2) =0,2037 m /s.
tm = L / u = 30 / 0,2037 ~147,3 s ou 2,5 min.
tR ~7 min , temps de rétention réduit 7-2,5 ~4,5 min.
4. Que signifie " ratio de split : 1 / 10" ?
Coefficient de fractionnement 1 / 10 : l'échantillon injecté est divisé en 10 parties et une seule entrera dans la colonne capilaire : on minimise la charge de la colonne.
3. La teneur en ibuprofène est déterminée par la méthode de l'étalon interne. L'étalon interne en question est l'acide 3-(4-chlorophényl)propionique ( noté IS sur le chromatogramme) . Expliquer en quoi consiste cette méthode. Comment se fait le choix de l'étalon interne ?
On compare les surfaces des pics du mélange avec un étalon servant de référence.
Premier chromatogramme : les concentrations sont connues en élléments à doser auquel on ajoute l'étalon. On détermine les coefficients  de proportionnalité.
me = ke A
e ; m1 = k1 A1 ; m2 = k2 A2
m1 / me = k1 /ke  A1 / Ae.
Second chromatogramme : on ajoute un volume connu  d'étalon au mélange à analyser. Le chromatogramme permet d'en déduire les fractions massiques du mélange.
m'i / m'e =
ki /ke  A'i / A'e.
L'étalon interne doit être bien séparé des autres pics ; son temps de rétention et sa concentration doivent être proches de ceux des élléments dosés ; il nne doit pas réagir avec les constituants du mélange.




Partie 2 : chromatographie en phase liquide.
L'ibuprofène peut être aussi détecté par HPLC. Les conditions chromatographiques sont les suivantes :  colonne "chromolith RP18 qui est une phase stationnaire en silice greffée C18 4,6 x 250 mm , 5µm.  Phase mobile : 70 % d'eau contenant 0,1 % d'acide phosphorique et 30 % d'acétonitrile. Débit  : 1 mL / min ; détecteur UV à 254 nm. On obtient un chromatogramme dont les caractéristiques sont les suivantes : 
N° du pic
Nom
tR en min
Largeur à mi-hauteur du pic ( d en min)
1
kétoprofène
2,050
0,074
2
fenoprofène
2,790
0,049
3
fluubiprofène
2,938
0,037
4
ibuprofène
3,235
0,074.

1. Rappeler en 3 lignes maximum, le principe de l'HPLC.
L'échantillon à analyser est poussé par une phase liquide dans une colonne contenant une phase fixe, constituée de grains de très petite taille, ce qui permet une meilleure séparation des composants.
Le débit de la phase mobile  étant elevé,  la pression augmente dans le système. Souvent la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse ( mode "gradient").
2. La colonne C18 greffée est-elle polaire ou apolaire ?
Les groupes alkyles greffés sur la phase stationnaire comptent 18 atomes de carbone. La colonne est apolaire.
3. Que représentent les valeurs indiquées pour la colonne : 4,6 x 250 mm ,5 µm ?
4,6 mm, diamètre interne ; 250 mm : longueur ;  5 µm : granulométrie.
4. Citez trois type de détedteurs utilisés en HPLC
Détecteur UV,
Réfractomètre ; spectromètre de masse ; conductimètre.
5. Pourquoi  travaille-t-on avec un éluant à pH acide ( pH< 3,5) ?
Les composés cités dans le tableau sont des acides carboxyliques de pKa voisin de 4,5.
A pH inférieur à pKa-1, la forme acide prédomine.
6. A partir des donnés du pic n° 4, calculer le nombre de plateaux théoriques.
N = 5,54(tR / w½)2 =5,54 (3,235 / 0,074)2~10588.
7. Calculer le facteur de résolution Rs des pics 2 et 3. Sont-ils bien résolus  ?
Rs
= 2[(tR(3)-tR(2) ] / (w3+w2) avec w3 =1,7*0,037=0,0629 et w2 =1,7*0,049=0,0833.
Rs= 2(2,938-2,790) / (0,0629 +0,0833)=1,0, valeur inférieure à 1,5 : les pics ne sont pas correctement séparés.
8. En vue d'augmenter le facteur de résolution entre les pics 2 et 3 quelle(s) est /sont la /les propositions correctes ?
a. augmenter le % d'acétonitrile de la phase éluante ;
(on augmente la polarité de la phase mobile )
b. augmenter le débit ;
Le temps de rétention est proportiennel au débit.
c.
diminuer le % d'acétonitrile de la phase éluante. (vrai ).
(on diminue la polarité de la phase mobile, donc son pouvoir éluant ; les temps de rétention augmentent










Exercice 3  : statistiques pour chimiste.
Dans le cadre de la quantification d'un produit dopant A dans les urines des sportifs, un test à blanc a été réalisé sur n = 4 échantillons.
Concentration estimée de A ( µg/L)
0,5
1
1,4
1,9

1. Déterminer la moyenne de ce test blanc. On considèrera que l'écart type est une bonne estimation de DX.
Xmoyen = (0,5 +1 +1,4 +1,9) / 4 =1,2 µg/L.
Variance : V = [(0,5-1,2)2 + (1-1,2)2 + (1,4-1,2)2 + (1,9-1,2)2] / 4 =(0,49 + 0,04+ 0,04 +0,49 ) / 4 =0,265.
Ecart type : 0,265½=0,514 ~0,5.
Xmoyen = 1,2 ±0,5 µg / L.
On exprime historiquement les limites de détection ( LOD) et de quantification ( LOQ) comme étant égales à resppectivement 3 et 10 fois la valeur de l'écart type sur le blanc augmentée de la valeur moyenne du blanc.
2. Définir  ce que représentent  LOD et LOQ puis  calculer  ces valeurs.
LOD : plus faible concentration d'une espèce chimique que l'on peut trouver dans un échantillon.
3 *0,5 +1,2 = 2,7 µg/L.
LOQ : plus faible concentration d'un produit à analyser dans un échantillon que l'on peut quantifier avec une précision et une exactitude acceptable dans des conditions expérimentales précisées.
10*0,5+1,2 = 6,2 µg/L.
3. On procède à la mesure de deux échantillons suspects. Le premier résultat donne une valeur de 2,5 µg/L et le second de 6 µg/L. Commentez ces  résultats.
2,5 est inférieure à la LOD mais proche et 6 est inférieure à la LOQ mais proche.
Il faudrait augmenter le nombre de mesures afin d'amliorer le seuil de détection et de quantification.
On risque de conclure à la présence de la substance recherchée alors qu'elle est absente, ou l'inverse.
4. Attribuer à chacune des cibles le bon terme : justesse, fidélité, exactitude.


Exactitude : bon accord  entre le résultat expérimental  et une valeur de référence.
Justesse : bon accord  entre la valeur moyenne obtenue à partir d'une grande série d'essais et une valeur de référence.
Fidélité : faible dispersion des résultats.
Cible 3. Fidélité et exactitude.
Cible 1 : fidèle et inexact.
Cible 2 : juste, mais pas fidèle.
5. Définir les termes suivants :
Répétabilité : mesure de la fidélité lorsque les mesures sont faites par un même opérateur, sur un même instrument et dans un délai court.
Reproductibilité :
mesure de la fidélité lorsque n'importe quelle condition change ( opérateur, instrument, délai d'exécution ...).


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