HPLC. Concours assistant d'ingénieur Maine 2015.

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1. Quels sont les trois principaux types de chromatographie ?
D'après la nature de la phase mobile : chromatographie sur couche mince ; chromatographie en phase gazeuse ; chromatographie en phase liquide.
D'après le type d'interaction : chromatographie d'adsorption ; chromatographie de partage ; chromatographie à échange d'ions.
2. Définir le principe de la chromatographie liquide haute performance.
L'échantillon à analyser est  entraîné par la phase liquide mobile dans une colonne remplie d'une phase stationnaire constituée de grains de petite taille. Un débit élevé de la phase mobile et cette fine granulométrie permet une bonne séparation des composants.
3. Faire un schéma de principe du fonctionnement d'un système de chromatographie liquide haute performance en indiquant les principaux composants.

La colonne ( tube construit avec un matériau inerte aux produits chimiques) contient la phase stationnaire :
- phase normale : gel de silice polaire ; on utilise un éluant apolaire ; les produits polaires sont retenus dans la colonne, les produits apolaires sortent en premiers.
- phase inverse : phase fixe apolaire ; éluant polaire ; les molécules polaires sortent en premier.
Détecteur UV-visible ; réfractomètre ( mesure de l'indice de réfraction du liquide à la sortie).
4. Classer les solvants suivants du moins polaire au plus polaire.
Cyclohexane ; chloroforme ; acétone ; DMSO ; acétonitrile ; éthanol ; méthanol ; eau.
6- 7. Qu'est ce qu'une colonne en phase inverse. Citer deux types de greffage de colonne en phase inverse.
 phase normale : gel de silice polaire ; on utilise un éluant apolaire ; les produits polaires sont retenus dans la colonne, les produits apolaires sortent en premiers.
- phase inverse : phase fixe apolaire ( colonne garnie de silice greffée C18 , phényl, CN) ; éluant polaire ; les molécules polaires sortent en premier.




8. Le dosage du chloramphénicol (CAP) est effectué en chromatographie liquide avec détecteur UV à 270 nm. La méthode de l'étalon interne est utilisée. Cet étalon est la caféine. Le solvant de dilution est le méthanol. Quatre points d'étalonnage sont réalisés :

Volume total = 1 mL
Concentration de CAP µg /mL
Concentration caféine en µg/mL
étalon point 1
10


10
étalon point 2
20
étalon point 3
30
étalon point 4
40
Chaque solution étalon est préparée comme suit :
A. Pesée de l'étalon interne.
Volume total final de la solution : 1 mL.
Concentration finale en caféine : 10 µg /mL, volume à ajouter : 20µL.
Calculer la concentration de la solution mère de caféine à préparer.
Facteur de dilution : 1 mL = 1000 µL ; 1000 / 20 = 50.
La solution mère est 50 fois plus concentrée soit 50*10 = 500 µg / mL ou 0,5  mg de caféine par  mL de solution ( 0,5 g / L).
Il faut peser 0,5 g de caféine et dissoudre le solide dans 1 L d'eau distillée à température modérée ( 40 - 50 °C). La solubilité de la caféine étant faible ( 2,2 g/L à 20°C) est plus importante à chaud ( 180 g/L à 80°C).
B. Ajout du chloramphénycol ( CAP).
A partir de la solution mère de CAP à 1 mg /mL ( 1000 µg / mL), calculer les volumes nécessaires à ajouter pour préparer 1 mL de chaque point de la gamme étalon.
Etalon 1 : facteur de dilution F = 1000 / 10 = 100. Prélever 10 µL de solution mère de CAP.
Etalon 2 :
prélever 20 µL de solution mère de CAP.
Etalon 3 : prélever 30 µL de solution mère de CAP.

Volume caféine
Volume CAP
Volume MeOH
Total
étalon point 1

20 µL
10 µL
970 µL

1000 µL
étalon point 2
20 µL
960 µL
étalon point 3
30 µL
950 µL
étalon point 4
40 µL
940 µL
.









Les résultats d'analyse sont les suivants :

Volume
injecté µL
CAP
µg/mL
CAP µg
Aire du
pic CAP
caféine
µg/mL
caféine µg
Aire du
pic caféine
étalon point 1
1
10
0,01
640
10
0,01
1147
étalon point 2
20
0,02
1268
1113
étalon point 3
30
0,03
1842
1100
étalon point 4
40
0,04
2400
1128
Echantillon inconnu


1375
1108

Calculer la quantité de CAP dans l'échantillon à doser.
L'aire sous le pic est en général proportionnelle à la quantité de matière injectée. Or le volume injecté est très faible et sa reproductibilité est insuffisante pour obtenir des résultats précis.
La méthode de l'étalon interne rend les résultats indépendants du volume injecté tant que l'on reste dans le domaine linéaire de réponse du détecteur.


étalon point 1étalon point 2étalon point 3étalon point 4échantillon inconnu
 Aire du pic CAP
par rapport à l'aire del'échantillon
0,5581,141,402,131,24
CAP µg0,010,020,030,04
On trace la courbe  aire du pic CAP/ aire pic échantillon en fonction de CAP µg.
y = 49,76 x +0,06 ;
x = (1,24-0,06) / 49,76 = 0,0237 µg.


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